Protocole pour sélectionner des anticorps qui dégradent leur antigène dans les cellules.

Il est important de pouvoir identifier et valider de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les protéines qui ne sont à ce jour pas ciblées par des inhibiteurs dans les cancers.

Les anticorps thérapeutiques sont des molécules de choix pour le traitement standard de nombreuses formes de cancers. Leur application est à ce jour restreinte au compartiment extracellulaire à cause de leur taille trop importante qui les empêche de traverser la membrane cellulaire. Comme la plupart des cibles thérapeutiques du cancer semblent être situées dans le milieu intracellulaire. Avec le développement de l’ingénierie génétique des anticorps, il a été possible d’utiliser des fragments anticorps recombinants produits dans des cellules en intégrant dans la cellule la molécule d’ADN nécessaire à sa production par la machinerie cellulaire. Ces anticorps peuvent être fonctionnalisés avec des domaines de dégradation par exemple. Une fois produit par la cellule, ils dégradent (on parle ainsi d’anticorps dégradeurs) leur cible et provoquer la mort cellulaire et donc la régression de la tumeur à terme.

Dans cette étude, l’équipe a développé un protocole détaillé pour la sélection d’anticorps intracellulaire « dégradeurs » en utilisant la technique du criblage cellulaire qui vise à identifier ceux qui possèdent une activité intéressante au niveau de la cellule, soit en modifiant une fonction cellulaire particulière, soit en agissant sur la cellule dans son ensemble.

Précédemment, cette équipe a employé cette méthode pour sélectionner des anticorps dégradeurs ciblant des fusions GFP (Moutel S, et al. Elife, 2016) et plus récemment la conformation active de la petite GTPase RHOB (RHB-GTP) en utilisant une lignée cellulaire modifiée (Bery N, et al. Cell Chem Biol).

Dans cette nouvelle publication, les anticorps sélectionnés par une technique in vitro (appelée phage display) sont directement fusionnés à un domaine d’une E3 ubiquitine ligase. Ce domaine permet l’envoi au protéasome de la protéine cible de l’anticorps qui est une machinerie cellulaire éliminant les protéines dans les cellules. Afin de visualiser la capacité de ces anticorps à dégrader leur antigène intracellulaire, nous avons fusionnée la protéine cible des anticorps à une protéine fluorescente qui est exprimée dans une lignée cellulaire. Lors du criblage cellulaire, un anticorps est considéré comme dégradeur s’il diminue le signal fluorescent de la protéine cible fluorescent. Nous avons utilisé ce protocole comme point de départ pour sélectionner un anticorps dégradant RHOB-GTP et étudier sa fonction dans divers processus cellulaires. Ce protocole peut être appliqué pour sélectionner à façon des anticorps intracellulaires « dégradeurs » qui pourraient être particulièrement utiles dans la lutte contre le cancer du pancréas.

Collaborations et remerciements

Ce travail a été effectué entre l’équipe 3 (Pr Gilles Favre, Dr Aurélien Olichon) et l’équipe 10 (Dr Nicolas Béry).

Ce travail est financé par la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe labellisée FRM [DEQ20170839117]) G.F. and A.O. N.B. est soutenu par une bourse de la Fondation de France

Une image

Images représentatives obtenues à partir du criblage cellulaire après transfection du plasmide dégradant à base d’anticorps intracellulaires (FBOX-intracellular Ab-IRES-MITO-GFP) dans la lignée cellulaire stable H2B-mCherry-RHOBQ63L. Le FBOX est un domaine de l’ubiquitine ligase E3. Les flèches blanches indiquent les cellules transfectées (mitochondries vertes) où une diminution de la fluorescence mCherry n’est observée qu’avec l’Ab2 intracellulaire FBOX dans la lignée cellulaire stable H2B-mCherry-RHOBQ63L.